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细说酶联免疫试剂盒的实验原理和操作步骤

发布时间:2021-05-23 点击量:47
  酶联免疫试剂盒实验中每一个步骤都尤为重要,细节不容忽视,它是实验成功的关键与否;在这里我司为方便各位了解,更好的完成实验,对酶联免疫试剂盒的实验原理和操作步骤做出以下分析,供大家参考:
 
  酶联免疫试剂盒的实验原理:
  用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
  
  酶联免疫试剂盒操作步骤:
  实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。
  1、加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。
  为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
  2、弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl,37℃,60分钟。
  3、温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
  4、每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl,37℃,60分钟。
  5、温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
  6、依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色。
  7、依序每孔加终止溶液50μl,终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
  8、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。