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在使用ELISA试剂盒之前,需要做好哪些准备工作?

发布时间:2021-06-27 点击量:33
  ELISA试剂盒是一种敏感性高,特异性强,重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,已广泛应用在免疫学检验的各领域中。
 
  ELISA试剂盒的组成:
  1、结合物及标本的稀释液;
  2、洗涤液,在板式elisa中,常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水;
  3、酶标记的抗原或抗体;
  4、酶的底物;
  5、阴性对照品和阳性对照品(定性测定中),ELISA试剂盒参考标准品和控制血清;
  6、已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂)。
 
  实验前的准备工作:
  1、准备好所有实验额外所需物品,如试管 吸头 移液器 离心机等;
  2、确定试剂盒在有效期内;
  3、仔细阅读说明书;
  4、按说明书确定所有试剂齐全;
  5、标本制备要规范,每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备,尽量分装做备份;
  6、根据检测标本数量确定所需试剂的量;
  7、按说明书将所用试剂盒平衡至室温,配制所需试剂。
 
  ELISA试剂盒的操作步骤:
  1、使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差;
  2、根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1:1稀释后加入50ul于反应孔内;
  3、加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时;
  4、甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次;
  5、每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟;
  6、甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次;
  7、每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟。避免光照;
  8、取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果;
  9、在450nm波长处测定各孔的OD值。